28 Nisan 1541 tarihinde Gelibolu'da doğmuştur. Babası Ahmed adında, ticaretle uğraşan ve Hırvat kökenli olduğu düşünülen bir mühtedidir. (Gelibolulu Mustafa Âlî, Mustafa İsen, Ankara, 1988) Okula altı yaşında başlamış ve Habîb-i Hamidî'den Arapça, kendisi gibi Gelibolulu olan Surûrî'den tefsir ve fıkıh dersleri almıştır.

Şiire başlamasında hocası Surûrî'nin etkisi büyüktür. İlk şiirlerini "Çeşmî" mahlasıyla yazmış, sonraları "Âlî" adını kullanmıştır. Gelibolu'da başlayan öğrenim yaşantısı, sonraları İstanbul Rüstem Paşa, Haseki ve Semaniye medreselerinde devam etmiştir.

Eğitimini tamamlamasını takiben 1561 yılında Şehzade Selim'in (II. Selim) yanına kâtip olarak girmiştir. Bu sıralarda ilk eseri olan "Mihr ü Mâh" kaleme almıştır. Şehzade Selim'in yanındaki hizmeti 1563 yılına kadar devam etmiştir. Daha sonra Şam'a giderek Şam Beylerbeyi Lala Mustafa Paşa'nın dîvan kâtipliğini yapmıştır. Mustafa Paşa'nın Yemen'in fethiyle görevlendirilmesi üzerine Paşa'yla birlikte Mısır'a gitmiştir. Ancak, çeşitli siyasi nedenlerle her ikisi de görevlerinden azledilmiştir.

Mustafa Âlî, Manisa'ya vali olan Şehzade Murat'ın (III. Murat) yanına gitmiş ve onun sayesinde 1569'da İstanbul'a dönmüştür. O sırada yazdığı "Heft-Meclis" adlı eserini Sokollu Mehmed Paşa'ya sunmuş ve ardından Kilis Sancakbeyi olan Ferhad Bey'in yanına 1570'te dîvan kâtibi olarak gönderilmiştir. Ferhad Bey'in Bosna Beylerbeyi olmasıyla onunla birlikte 1574 yılında Banyaluka'ya gitmiştir.